灣區(qū)時(shí)訊 近日，中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所張長(zhǎng)生研究員團(tuán)隊(duì)和廈門大學(xué)王斌舉教授團(tuán)隊(duì)合作在P450酶催化糖肽分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)的機(jī)制研究方面取得新進(jìn)展，相關(guān)成果“Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C−O Phenol Coupling Reactions”發(fā)表于Journal of the American Chemical Society（《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》）。南海海洋所博士方春艷、副研究員張麗萍和廈門大學(xué)博士汪永超生為論文共同第一作者，南海海洋所研究員張長(zhǎng)生、研究員朱義廣和廈門大學(xué)教授王斌舉為共同通訊作者。

在化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，細(xì)胞色素P450酶因其獨(dú)特、多樣的催化能力而備受矚目。P450酶催化的分子內(nèi)C−O和C−C苯酚偶聯(lián)反應(yīng)在天然產(chǎn)物生物合成中扮演著關(guān)鍵角色，廣泛存在于糖肽類抗生素如萬(wàn)古霉素和**拉寧中。雖然糖肽類抗生素中多個(gè)催化分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)P450酶的功能和晶體結(jié)構(gòu)相繼被解析，但底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)的缺失導(dǎo)致該類反應(yīng)的催化機(jī)制一直是未解之謎。

研究團(tuán)隊(duì)從放線菌Amycolatopsis cihanbeyliensis DSM 45679中發(fā)現(xiàn)了C−O連接的新型雙環(huán)糖肽類化合物cihanmycins（CHMs, 圖1）。CHM A (1)的結(jié)構(gòu)通過(guò)X-ray單晶衍射確定為雙環(huán)糖肽，包含肉桂酰基團(tuán)和兩個(gè)稀有的d-阿拉伯呋喃糖。研究團(tuán)隊(duì)基于生物信息學(xué)分析和異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)，在DSM 45679的基因組中定位了CHM的基因簇，并通過(guò)體內(nèi)基因敲除和體外生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了3個(gè)P450酶的功能：Cih26負(fù)責(zé)肉桂酰基團(tuán)的環(huán)氧化和羥化，Cih32負(fù)責(zé)三個(gè)氨基酸的羥化，Cih33及其同源蛋白DmlH和EpcH催化分子內(nèi)C−O苯酚偶聯(lián)反應(yīng)形成CHM的雙環(huán)骨架（圖1）。

圖1. CHM生物合成中3個(gè)P450酶的功能

為揭示Cih33及其同源蛋白催化C−O苯酚偶聯(lián)反應(yīng)的機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)開展了晶體學(xué)研究并解析了DmlH和DmlH−7復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，首次揭開了分子內(nèi)C−O苯酚偶聯(lián)P450酶與大環(huán)肽結(jié)合模式的神秘面紗。同時(shí)，單環(huán)底物7的柔性結(jié)構(gòu)使其NMR信號(hào)裂分復(fù)雜，難以解析結(jié)構(gòu)，而DmlH−7的結(jié)構(gòu)獲取提供了通過(guò)復(fù)合物晶體鑒定小分子結(jié)構(gòu)的經(jīng)典案例。值得注意的是，底物7與DmlH的輔因子血紅素（heme）平面之間有一個(gè)水分子，可能在苯酚偶聯(lián)反應(yīng)的攫氫過(guò)程中起關(guān)鍵作用。為驗(yàn)證這一推測(cè)，研究團(tuán)隊(duì)開展了分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬和量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）計(jì)算，揭示了DmlH催化分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)由水介導(dǎo)的雙自由基機(jī)制（圖2），首次提出了水分子在雙自由基苯酚偶聯(lián)反應(yīng)中的重要作用。

圖2. 分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)由水介導(dǎo)的雙自由基機(jī)制

（注：“*”為羥化氨基酸，“CM”為肉桂酰基團(tuán)）

此外，基于生信分析，從數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘到81個(gè)含有Cih33同源蛋白的肽類基因簇。對(duì)這些基因簇的P450酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)催化分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)的Cih33/DmlH/EpcH和糖肽類抗生素的P450酶都聚集在同一分支，表明該分支中的其他P450酶可能具有相似的功能和機(jī)制，編碼這些P450酶的基因簇有望產(chǎn)生新穎的雙環(huán)肽類化合物。

綜上所述，本研究證實(shí)了雙環(huán)糖肽類化合物CHM生物合成中3個(gè)P450酶的功能，并利用酶學(xué)和計(jì)算化學(xué)等方法首次揭示了DmlH催化分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)由水介導(dǎo)的雙自由基機(jī)制，為深入理解P450酶催化的分子內(nèi)苯酚偶聯(lián)反應(yīng)提供了新的視角，還為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)更多新穎的雙環(huán)肽類化合物奠定了研究基礎(chǔ)，有望為抗生素研發(fā)提供更多物質(zhì)基礎(chǔ)。

以上研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“合成生物學(xué)”重點(diǎn)專項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金委重大項(xiàng)目、中國(guó)科學(xué)院王寬誠(chéng)率先人才計(jì)劃、廣東省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目資助。

相關(guān)論文信息：Chunyan Fang^†, Liping Zhang^†, Yongchao Wang^†, Weiliang Xiong, Zier Yan, Wenjun Zhang, Qingbo Zhang, Binju Wang*, Yiguang Zhu*, and Changsheng Zhang*. Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C−O Phenol Coupling Reactions. J. Am. Chem. Soc. 2024. DOI: 10.1021/jacs.4c02841.

文章鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c02841

通訊員/謝文燕 王沐眾 徐曉璐

責(zé)任編輯/劉秀